1. 规格说明书

1.1 定义

1.2 描述

1.3 功能利用

1.4 鉴定

1.5 纯度

1.6 测定方法

2. 数据表

2.1 鉴定

2.2 纯度

*产品分析结果

*高压液相色谱法(HPLC)和(气相色谱法 + 分光光度计)方法的区别

2.3 甜菊糖苷的热稳定性

2.4 甜菊糖苷(20℃)在酸性液体中的稳定性

2.5 甜菊糖苷在酸性饮料中的稳定性

3. 技术数据

      * 生产(甜菊糖苷的生产流程图)

1. 规格说明书

甜菊糖苷

1998年，当埃及提议建立甜菊糖苷每日容许摄入量(ADI)时，JECFA指出，在1999年召开的JECFA第51次会议上建立ADI数据不足。

在2004年6月，JECFA还认可了作为一种甜味剂的甜菊糖苷的每日容许摄入量，指定临时摄入量为2 mg/kg/日(甜菊醇)。临时规定是基于这样的事实，即高剂量的甜叶菊甜味剂消费对于患高血压病人具有抗高血压作用，而且对于2型糖尿病人具有降低血糖的作用。简单地说，是由于作为甜味剂的每日容许摄入量与其药理作用的每日容许摄入量不同。

涉及说明书的指明的项目

（1） 总甜菊糖苷不能低于95%；

（2） 甜菊糖苷所有组成成分，包括试验性规格没有鉴别出的成分的分布和浓度的分析数据；

（3） 测定甜菊糖苷各种成分，包括在试验性规格没有鉴别出的成分的分析测定方法；

（4） 不含甜菊糖苷分馏物的性质和浓度；

（5） 生产过程中分离和纯化过程残留溶剂的数量；

（6） 酸性食品和饮料中甜菊糖苷的水解稳定性。

1.1 定义：甜菊糖苷是用热水第一次从甜叶菊(Stevia rebandiana Bertoni)叶子中提取，然后通过对提取物进行柱纯化后得到的产品。其主要成分是甜菊糖苷 (stevioside) 或者是菜包迪苷A (rebaudioside A)。次要成分是rebaudioside C和dulcoside A。较次要的成分是rubusoside、steviolbioside 和 rebaudioside B, D, E, F。

化学名称：甜菊糖苷(stevioside)：

C.A.S 编号：甜菊糖苷 ：57817-89-7

            rebaudioside A: 58543-16-1

            rebaudioside C : 63550-99-2

            dulcoside A:    64432-06-0

            rubusoside:     63849-39-4

            steviolbioside： 41093-60-1

            rebaudioside B：58543-17-2

            rebaudioside D：63279-13-0

            rebaudioside E：63279-14-1

            rebaudioside F：438045-89-7

化学式：

化学式量：

结构式

       甜菊糖苷：

1. 以干物质为基础进行计算，总甜菊糖苷(10种成分)不低于95.0%。

1.2 描述：白色、浅黄粉末，无味或者具有轻微特殊味道。

          比蔗糖大约甜200-300倍。

1.3 功能利用： 甜味剂

特征：

1.4 检定：秤取0.5 g甜菊糖苷，并溶于100 ml水。应用该液体为样品溶液。分别秤量甜菊糖苷和rebaudioside A大约各5 mg用于实验，并溶于10 ml水。应用该溶液作为标准液。应用样品溶液和标准液，以液相色谱为指导按下述操作条件进行检验：样品溶液主峰的保持时间与标准液的主峰保持时间相同。

溶解度：在水和乙醇中易溶解

pH: 5.0-7.0之间 (1:100 溶液中)

1.5 纯度

铅：低于1 mg/kg (原子吸收法)

砷：低于1 mg/kg (原子吸收法)

干燥损失：不能大于6.0% (样品1.0 g, 105℃，2小时) (甜菊糖苷更具吸收力)

灰分：不能大于1.0% (样品1.0 g)

残留溶剂：MeOH不能大于300 mg/kg (气相色谱法)

1.6 检定方法：

检定： 准确称量60-120 mg甜菊糖苷，在流动相溶解，配置成100 ml溶液，用此溶液作为试验溶液。另外，准确称量50 mg预先干燥的甜菊糖苷用于检定，在流动相溶解，配置成准确的100 ml溶液，用此溶液作为标准液。用吸管分别吸取10 µL(微升)试验液和标准液，并按照下述操作条件进行液相色谱试验。

测定甜菊糖苷的峰面积Aa，dulcoside A的峰面积Ab，rebaudioside A的峰面积Ac，rebaudioside C的峰面积Ad，rubusoside 的峰面积Ae，steviolbioside 的峰面积Af，试验溶液的rebaudioside B的峰面积Ag，标准液的甜菊糖苷的峰面积ASa, 并用下述公式计算甜菊糖苷的含量。然而，对于甜菊糖苷而言，rebaudioside A(1.00)的相对保持时间是0.45-0.48，对于dulcoside A是0.25-0.30， 对于rebaudioside C是0.63-0.69，对于rubusoside是0.12-0.16，对于steviolbioside是0.35-0.41，对于rebaudioside B是0.73-0.79。

甜菊糖苷含量 = 

    检测秤量的甜菊糖苷量(mg)          Aa

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)    ASa

dulcoside A的含量 = 

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)              Ab ⅹ0.98

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)       ASa

rebaudioside A的含量 =

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)              Ad x 1.20

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)      ASa

rebaudioside C的含量 =

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)              Ad x 1.18

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)      ASa

rubusoside的含量 =

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)              Ae x 0.80

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)      ASa

steviolbioside的含量 =

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)               Af x 0.80

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)       ASa

rebaudioside B的含量 =

检测秤量的甜菊糖苷量(mg)               Ag x 1.00

在干燥基础上计算的秤量的样品量(mg)       ASa

甜菊糖苷总含量 = 

甜菊糖苷含量(%) + dulcoside A的含量(%) + rebaudioside A的含量(%) + rebaudioside C的含量(%) + rubusoside的含量(%) + steviolbioside的含量(%) + rebaudioside B的含量(%)

操作条件

检测器      紫外线吸收光度计(波长210 nm)

柱的填充    液相色谱为氨基结合的硅胶 (孔道尺度为5 µm)

柱          不锈钢柱，内部直径4.6 mm，长度为15 cm

柱温        40℃

流动相      乙晴和水(4:1)的混合物

流速        调整流速，这样rebaudioside A的保持时间大约是21分钟

   

参考信息    

        柱的填充    Unisil QnH2 或者当量

[检测用的试剂和试液]

用于检测的甜菊糖苷  C38H60O18

描述                用于检测的甜菊糖苷是白色结晶粉末或者粉末。

检定                将0.6 g甜菊糖苷溶于100 ml水中用于检定，再加入100 ml L-丁醇， 充分摇动，并使之静止。将5 ml L-丁醇注如入试管，并缓缓添加5 ml 蒽酮 TS，并使之从试管边流下：在两种液体接触区就会产生一种蓝绿色。

纯度                相关物质

                    将甜菊糖苷溶解在流动相50 ml水中，并用该溶液作为试液。吸取1 ml这种溶液，添加到流动相中，以制成100 ml溶液，并用该溶液作为对照液。用吸管分别吸取10 µL(微升)试验液和对照液，并按照下述操作条件进行液相色谱试验，并确定两种溶液的峰面积：试验液除主峰之外的其他峰总面积不大于对照液的峰面积。但是，由于溶剂的原因，测量范围是峰后主峰保持时间的两倍。 

操作条件            操作条件与“甜叶菊提取物”鉴定中详细说明的操作条件相同。但要调整流速，这样甜菊糖苷的保持时间大约是10分钟。

干燥损失：          不能高于5.0% (105℃，2小时)

参考信息

    柱的填充        Wakosil 5NH2 或者当量

rebaudioside A        C44H70O23

描述                Rebaudioside A是白色结晶体或者结晶粉末。

旋光率              [∝]24D = -20 - 24°

                    秤取50 mg rebaudioside A，预先在110℃下干燥2小时，溶解在50 ml甲醇，并测定其旋光度。

熔点                239-244℃

进行液相色谱的氨基结合的硅胶

见进行液相色谱的氨基结合的硅胶 

进行液相色谱的氨基结合的硅胶 

是为进行液相色谱而生产的一种产品。

甜菊糖苷的高压液相层析(HPLC)图

                               图

                   Rebaudioside D、E、F (未检测到)

    产品是通过再结晶作用过程检测的，以保证甜菊糖苷的总含量在95%以上。采用这种方法，不重要的组分rebaudioside D、E、F很难于检测到。只有主要的组分被检测到，即甜菊糖苷、rebaudioside A、B、C, dulcoside A 和steviolbioside。

1. 数据表

2.1 检测

红外光谱： 样品溴化钾分散的红外光谱与下述参考红外光谱相当。

熔点：     甜菊糖苷        198℃

           rebaudioside A    242℃

旋光率：   甜菊糖苷：[α]25，D: -39.3°   (c = 5.7 in H2O)

           rebaudioside A：[α]24，D: -22.0°   (c = 0.2 in 甲醇)

                         [α]25，D: -29.4°   (c = 0.6 in 吡啶)

2.2 纯度：     

重金属：   不高于20 mg/kg（样品1.0 g）

           标准液：标准铅溶液2,0 ml。

*产品的分析结果：

        高甜菊糖苷含量的实际分析结果

高Rebaudioside A含量的实际分析结果

[组分和成分的变化]

原来的产品含48-54%的甜菊糖苷和18-25%的rebaudioside A。由于原料是一种植物，其含量受栽培年份的温度、纬度(日照长度)、收获时间等的轻微影响。

另外，在改良产品中，具有良好口味的rebaudioside A的含量增加到50-70%，而甜菊糖苷降低到25-8%。 作为次要组分的Rebaudioside C和dulcoside A的含量分别为7-10%和1-4%， 两种禅林都比较稳定。

尽管组分和成分改变了，但由于采用非常先进的纯化技术，作为甜菊糖苷的产品纯度保持稳定。

[残余物组分]

产品是由非常先进的纯化再结晶方法加工的，总甜菊糖苷的纯度提高到95%以上。另外，所含的多糖含量为2-3%。

[其他方法] *高效压液相色谱法(HPLC)和（GC+分光计）方法

    下述表格显示，典型的甜菊糖苷含98.99%的总碳水化合物，这些总碳水化合物含10种大约96%甜菊糖苷，包括甜菊糖苷和糖苷配基、甜菊醇和糖类或者多糖。

在2002年出版的日本添加剂协会对目前食品添加剂说明书(第三版)中，对用α-葡糖基转移酶处理的甜叶菊的甜菊糖苷和糖类的分析方法介绍如下。

[方法]

甜味剂在105℃干燥2小时。准确秤量1.0 g干甜味剂，然后溶于500 ml水中。

准确秤量6 ml蒽酮试剂，并加入准确秤量的2 ml试液的玻璃试管，在冰水中冷却，然后充分摇动溶液，直到完全混合。然后混合液在沸水浴中加热16分钟。用冰冷却后，测量波长620 nm 时的吸光率，用清水作为对照。

蒽酮试剂的制备方法如下：将200 mg蒽酮溶于100 ml 硫酸，然后将此溶液慢慢加入20 ml水中，并用冰冷却。

然后，与先前制备的葡萄糖校正曲线对照，测定试液的葡萄糖浓度(μg/ml)。通过与试液情况中相同的方式，应用浓度为10μg/ml, 30μg/ml和50μg/ml的标准液产生了葡萄糖校正曲线。

甜菊糖苷中的糖类的重量百分比用下列公式测定：

B = b × 0.9 × 50 × 500 × 100/Y × 1000 × 1000 = 2.25b/Y …..方程式 （2）

式中

B = 葡糖苷中的糖的重量百分比

b = 从校正曲线测定的糖浓度(μg/ml)

Y = 样品的采样量 (g)

甜味剂在105℃干燥2小时，称取大约100 mg甜味剂添加到烧瓶中，然后加入20 v/v%的硫酸10 ml (在100 ml硫酸混合溶液中的硫酸含量，水是20 g)。在流动水中冷却后，用有回流冷凝器的水浴设备加热2小时，加热后的含量装入分液漏斗，烧瓶用10 ml水清洗，并加入分液漏斗。烧瓶每次用30 ml乙醚再洗三次后，洗涤与分液漏斗结合，充分摇动，然后使之静止。将水层去掉，乙醚层用20 ml水洗两次，然后将水层去掉。将乙醚层转移到另一个烧瓶，分液漏斗每次用10 ml乙醚共清洗两次，洗涤装入分液漏斗，并加入15 g硫酸钠(酐)。充分震荡和倾斜，乙醚层转移到另一个烧饼进行静止。剩余的硫酸钠每次用10 ml乙醚洗涤两次，洗涤液装入一个烧瓶。乙醚蒸馏之后，剩余物溶于添加的10 ml醋酸乙酯和加入3 ml 2 w/v%重氮甲烷-乙醚溶液(100 ml重氮甲烷-乙醚的回合液中重氮甲烷的含量)。塞住口后，摇动混合液，并使之静止20 分钟。

将0.5 ml醋酸加入该溶液制备试液，充分摇动，并精确加入2 ml角鲨烯-n-丁醇溶液(将2.5 g角鲨烯溶于n-丁醇并添加n-丁醇最后达到200 ml制备成角鲨烯-n-丁醇溶液)。

另外，纯度为99.4%的甜菊糖苷是由沃克普耳化学有限公司（Wako Pure Chemical Indusries Led.）生产的。是在105℃下干燥2小时，然后称取大约50 mg甜菊糖苷加入烧瓶，以与甜味剂例子中相同的操作方法制备标准液。

按下述操作条件用气相色谱方法分析试液和标准液。

检测器：氢火焰电离检测器

柱填充物：液相是比例为载体2%的50%苯基甲基硅铜聚合物，而气相色谱所用的载体为硅藻土(颗粒大小：177-250 µm) [硅铜 OV-17，2% Chromosorb WAW-DMCS 60/80 (由GL Science Inc.有限公司生产)]。

柱管：尺寸为3.2 mm × 2.1 mm的玻璃管。

柱槽温度：245℃

注射口温度：260℃

载体气体：氮气

流速：50 ml/min

注射量：2 μL

测定了试液角鲨烯和异甜菊醇（isosteviol） 甲酯的峰面积和标准液的角鲨烯和isosteviol 甲酯的峰面积。

应用下述公式从所获得的峰面积测定了甜味剂中的甜菊醇的重量百分比：

A = As × S × 参考标准的甜菊糖苷的纯度× 100 × K

                     Ast × X                          …….公式 （1）

式中：

   A: 作为样品的甜菊醇的重量百分比，

   As： 作为试液的异甜菊醇甲酯的面积与角鲨烯的面积比，

   Ast: 作为标准液的异甜菊醇甲酯的面积与角鲨烯的面积比，

   S: 甜菊糖苷的采样量 (mg)

   X: 样品的采样量 (mg)

   X: 甜菊醇的换算系数，318.46/804.88 = 0.3957。

如在A1中所解释的那样，占产品2-3%的“纯化的甜菊提取物”的未鉴定成分估计含有多糖，其成分为葡萄糖、鼠李糖、木糖。

从元素成分分析的结果得出的结论是没有含氮化合物，矿物含量低于1%。

2.3 甜菊糖苷的热稳定性

              （图）

                           热稳定性 (80℃)

                   甜菊产品的残留量（%）             pH = 4.0

                                                      pH = 3.0

                           加热时间 （小时）

               

（图）

                          热稳定性 (100℃)

                   甜菊产品的残留量（%）             pH = 4.0

                                                      pH = 3.0

                                                      pH = 6.0

                                                      pH = 8.0

                           加热时间 （小时）

             *在80℃，pH 3- 8时稳定4小时

             *在100℃，pH 4- 8时稳定4小时

甜菊糖苷的特征是易于溶于水，如上图所示，在加热时稳定。

2.4 甜菊糖苷在酸溶液中的稳定性(20℃)

                  （图）

                       甜菊糖苷在酸溶液中的稳定性(20℃)

 

                   浓度（%）                          pH = 2

                                                       pH = 4

                                   天

           pH 通过柠檬酸调节

    *pH 为2-4时，在20℃条件下稳定180天。

2.5 甜菊糖苷在酸性饮料中的稳定性。

稳定性实验条件 ：pH = 3.8

                 温度 = 25℃

                 货架寿命 = 1年

                      （图）

                                   甜菊糖苷

     *甜菊糖苷 = 甜菊苷 + rebaudioside A + rebaudioside C

     *pH 为3.8时，在25℃条件下稳定1年 （饮料）。

3．技术数据

*生产(甜菊糖苷加工流程图)

〇次要甜味组分：Rubusoside, 甜菊醇B甙，Reebaudioside B、D、E、F

 

中国甜菊协会组织翻译