[甜菊安全性评估]甜叶菊新的栽培种的甜双萜糖苷平衡:通 
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  甜菊安全性评估  

[甜菊安全性评估]甜叶菊新的栽培种的甜双萜糖苷平衡:通
Antonio S. Dacome, Cleuza C. da Silva, Cecilia E. M. da Costa 等
 
巴西马林加
 
1. 引言
 
甜叶菊(Stevia rebaudiana)是原产巴拉圭的一种植物,在很早以前, 居住在巴拉圭的印地安人和当地的居民用甜叶菊的叶子作甜茶和甜味制剂。在9种已知的甜味双萜甜菊甙中(表1),甜菊醇或者13-羟基kaur-16-en-18-酸是唯一的糖苷配基(图1),甜菊糖苷和Rebaudiana-A (菜包迪苷A)为主要成分,都显示出甜度比蔗糖大300倍。在巴西的帕拉纳州,也广泛栽培甜叶菊用于作为工业原料。
自上世纪70年代以来,当日本研究人员开发出一系列提取和提炼叶内的甜味剂技术以来,提高了对甜叶菊的开发的力度。日本每年对甜叶菊干燥的叶子提取物的消费量大约是200吨。
甜叶菊叶子中天然的甜菊糖苷与菜包迪苷A的比例通常为2。由于其含量高,因而在品尝粗提物后甜菊糖苷具有苦味。相反,最有价值的提取物是作为主要成分的含菜包迪苷A的提取物,由于其感官上和理化性质,相对于所有其他即它糖苷而言,它的味道最好,在水中的溶解性最高,这样就能做成各种配方。因此,就改良和利用这一天然甜味剂来源而言,寻找和鉴定菜包迪苷A含量高的甜叶菊新的栽培品种是研究人员和工业加工的根本目的。
 
1. 从甜叶菊的甜菊醇衍生的甜味剂类

双萜糖苷
R
R1
相对甜度
参考文献
甜菊糖苷
β-Glc
β-Glc2-β-Glc1
250-300
Briedel and lavieille
甜菊醇B甙
H
β-Glc2-β-Glc1
100-125
Kohda等
菜包迪苷-A
β-Glc
β-Glc2-β-Glc1
350-450
idem
菜包迪苷-B
H
β-Glc2-β-Glc1
300-350
idem
菜包迪苷-C
β-Glc
β-Glc2-α-Rha1
50-120
Sakamoto等
菜包迪苷-D
β-Glc2-β-Glc1
β-Glc2-β-Glc1
200-300
Sakamoto等
菜包迪苷-E
β-Glc2-β-Glc1
β-Glc2-β-Glc1
250-300
idem
杜尔可甙
β-Glc
β-Glc2-α-Rha1
50-120
Kobayashi等
菜包迪苷-F
β-Glc
β-Glc2-β-Xyl1
未测定
Brandle 等

注:Glc=Glucose; Rha=rhamnose; Xyl=Xolose;
    蔗糖的甜度=1
 
甜叶菊UEM-320是马林加(Maringa)州立大学从上棵植株中筛选出的一个品种,菜包迪苷A的平局含量为3.8%,甜菊糖苷的含量为9.1%, 该品种的新鲜叶子直接咀嚼或者制成茶,显示出意想不到的和称心如意的以及大大降低的苦味道。巴西的STEVMAX Edulcoranted Naturia 公司正在对用微繁殖方法繁殖的这一品种进行集约化栽培,目的是在确认了该品种的基因稳定性后对其植物化学特征进行研究。然后对这个新的甜叶菊品种UEM-320两个主要参数进行测定,即叶子双萜甜菊甙的总含量和主要的糖苷的相对组成,以便检验这些成分是分离的还是相结合的,这些定性能够对初步发现的该新品种味道改善作出解释。
 
2. 实验
 
2.1 植物材料
 
甜叶菊UEM-320是2000年12月在巴西帕拉那州南然达亚的伊瓦依河谷的试验站收集到的,经过干燥的材料存放在巴西马林加州立大学的植物标本室,编号为9131。为进行比较分析,也从帕拉那州的卡罗尔收集到一个普通栽培种。
 
2.2 双萜甜菊甙的提取和通过高压液相色谱分析法(HPLC)进行的初步分析
 
经过干燥和研磨的甜叶菊叶子(2.0 g)用70 ml水(用0。01 M pH 7的磷酸钠轻微缓冲)在100℃条件下搅拌5分钟进行提取,然后将溶液进行真空过滤。提取过程重复两次,这样,使提取物的体积达到250 ml时结束。取15 ml溶液在旋转式蒸发器中浓缩干燥,并用10 ml流动相液体进行再复溶(乙腈:水,80:20, V/V)。进行常规分析,将20μL 0.5μm微空过滤的溶液注射进CG型480-C(巴西)液相色谱装置,该装置装有NH2-硅柱(125.0mm × 4.6 mm), 在室温下以0.75 mL/min的流速无梯度操作,并用Waters 410 DRI检测器进行监测。选择的样品在来自SpectraPhysics 公司的220 mm × 6.6 mm 的氨柱重新进行分析,该柱用10μm LiChrosorb 吸附剂填充,并用80%乙腈在流速为0.8 ml/min条件下洗脱。由于甜菊糖苷不吸收可见光,因而在190nm处监测到了洗脱高峰。
应用根据Bridel 和Lavieille 以及Payzant 等人的方法获得的甜菊糖苷和菜包迪苷A的外部标准对甜菊糖苷进行了定量分析。除了用清水提取的样品之外,其他的样品,例如衍生的粉末和用有机溶剂提取得到的较极性提取物,只要水中甜菊糖苷的浓度范围在1-2 mg/ml, 也用同样的方法进行了分析。
 
2.3 非甜味和甜味甜菊糖苷的提取和分离
 
干燥和研磨过的甜叶菊UEM-320的叶子(600 g)用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇在室温条件下经过连续浸渍后彻底提取,每一种有机提取过程是24小时。5g二氯甲烷提取物通过硅胶柱(V1=200 mL)色谱法用上述同样的溶剂溶解连续溶解进行分馏,其中间洗脱液在所用的两种有机溶剂之间经常是不断增加的极性梯度。从所得到的16种分馏物中,馏分8被再进行色谱,但增大己烷中二氯甲烷的梯度混合物。从72种细馏分中,将馏分31-45混合在一起(35.2 mg),并进行第3次和最后的色谱分析,重复己烷中的二氯甲烷梯度,得到66种馏分,从作为游离植物甾醇的无污染物的混合物的物质而回收了馏分12-16,正如核磁共振(NMR)预监测所表明的那样,并进一步通过气相色谱法和质谱分析方法(GC-MS)分解。
从第一次色谱得到的馏分15 (1.5 g)也在硅胶柱再进行色谱分析,但在甲醇中用乙酸乙酯进行洗脱,直到最后洗脱液中含有纯甲醇产生的9种馏分。从细馏分(3)的沉淀得到174.0 mg特殊的物质,该物质在甲醇重新结晶后,最后得到通过核磁共振方法定性的糖苷形式的植物甾醇。在第一次色谱分析中,如果使用的梯度中甲醇大于3%,从乙酸乙酯洗脱液中也得到这些相同的物质。
将第一次提取过程得到的最后的家村提取物(5.0 g)用氯:甲醇:水的比例梯度为45:9:1 到20:20:2进行硅胶柱色谱分析,以求得双萜糖苷的下游。
作为最后的色谱分析的替代方法和考虑到从甜叶菊中可提取物的复杂性,开发了一种与物理和化学清洁措施相结合的水提取方法。将干燥和研磨过的甜叶菊UEM-320的叶子(600 g)在50℃条件下通过渗滤用水提取,接着按以下步骤进行:(a) 通过一张30,000 Da 聚砜类膜进行超滤;(b)用阳离子(SAC/B-252)和阴离子(WBA/IRA-96SB)交换树脂柱去除渗透色素(Hohm 和Haas);(c)在500 kDa截流聚胺膜通过逆向渗透浓缩洗脱液;(d) 在喷雾干燥器中干燥浓缩物。将每一个处理步骤得到的样品收集起来,干燥,重新溶于二甲亚砜,并用Pharmacia UV1650PC分光光度计对照溶剂空白,读取可见的和近紫外线范围的数据。5g这种最后的无水粉末用上述相同的三氯甲烷:甲烷:水的梯度溶解后在硅胶柱中加工(Vt = 150 ml)。在61种馏分中,将标号为32和40的馏分用核磁共振技术对主要的三抗四-糖化双萜(3和4)的特征进行鉴定。
 
2.4 薄层色谱法
 
采用了Merck 的硅胶(SG60)薄层色谱板对甜菊甜味剂进行薄层色谱(TLC)分析,以异丙醇:乙酸乙酯:丙酮:水(30:53:2:15, v/v)作为流动相,在10-5℃下加热2-4分钟后,以甲醇:硫酸(95:5)中0.5%的地衣粉作为启动子。糖衍生物色谱斑在Shimadzu flying-spot 型CS-9301PC光密度计最大吸附波长(560 nm)加工。
 
2.5 毛细管电泳
 
毛细管电泳(CE)在Agilent仪器进行,应用70 cm长,内直径为50 μm,熔凝硅石毛细管在28 kV/70 μA,在50 mbar静力注射2秒钟后,25℃条件下电泳15 分钟。缓冲剂为30 mM、pH 10.3四硼酸钠,含3 mM γ-环糊精,22.5%乙腈和15%甲醇作为溶剂极性改性剂。
 
2.6 气相色谱分析和分光镜分析
 
在型号为Gemini 2000 BB 300 MHz (1H为300.6 MHz, 13C为75.45 MHz)的VARIAN分光计上获得了1H和13C的RMN光谱。以给予的化学位移物为ppm,TMS作为内部参考(δ= 0.0 ppm)。所用含氘的溶剂为CD3OD和C5D5N(从Aldrich 和Isotec公司得到)。实验数据的解释,旨在阐明通过1H和13C/DEPT 135 和90以及HETCOR(131H)的RMN的技术所得到的化合物的结构式。在Shimadzu QP 2000 A型气相色谱仪与质谱仪结合(CG/MS)在70 eV 时得到低分辨质谱。
 
3. 结果和讨论
 
3.1 提取程序、柱分馏和产量
 
几乎所有的甜叶菊的甜味成分双萜糖苷都集中在植物的叶子中。对这种干物质材料进行的连续有机溶剂提取获得两种含有葡萄糖作为糖成分的糖苷。用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇连续提取分别获得的产物为18.5 g, 10.2 g, 3.6 g和188.9 g。从硅胶色谱步骤中,当将甲醇逐渐添加进较少极化的溶剂乙酸乙酯作为流动相,获得了植物甾醇糖苷配基衍生的化合物,即β-谷甾醇和豆甾醇。在此情况下,经过重新结晶后,600 g干叶子中的全部葡糖基化的植物甾醇总计为35.3 mg (28.8 + 6.5)。葡糖基化的植物甾醇洗脱后,在含90%二氯甲烷的己烷的洗脱液中得到游离糖苷配基(产量6.8 mg )。用甲醇进行的最极化提取步骤中,含有主要的葡糖基化形式的甾醇,即甜菊糖苷(一种三葡糖苷)和rebaudioside-A(一种四葡糖苷),除此之外,还有一个大族多相化合物,未得到其各个组分纯化合物的量。为此目的,采用了按比例增加从叶子中的水提取物。通过用具有30kDa截断的初始膜进行超滤(粗脱去蛋白质化)、用阳离子和阴离子树脂双床进行的离子脱盐(去除绿色色素、低m.w.蛋白质的清除)、在0.5 kDa截断多胺膜上进行反渗透,最后通过喷干脱水得到白色粉末,从而使所有双萜葡糖苷更丰富。如图2所示,上面概述的水提取预处理导致深绿色物质大大减少,并且也可能还有粗提物的蛋白质物质减少,然后获得几乎无色的甜菊糖苷溶液。最后的制备物(5.0 g)进行硅胶色谱,然后应用三氯甲烷:甲醇:水为40:20:2的洗脱梯度区回收纯甜菊糖苷(161.0 mg)和rebaudioside-A (260.8 mg)。
 
 
 
图2. 甜叶菊栽培种提取物的薄层色谱:野生类型(wt)和320 = 甜叶菊野生类型和栽培种UEM-320叶子的水粗提物;c 和p = UEM-320的粗提物和纯化物; glu, M2, M3, SB = 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和甜菊醇B甙标准; 0.1-1.0 =甜菊甙 (S)和rebaudioside (R)的等量混合物的校正曲线。
 
                                                  (小图)
                                       粗提取物(在DMSO中)的扫描光谱
 
                                        吸光率
                                                      波长(nm)
 
吸光率
                                 波长(nm)

粗提取物               半纯化提取物           纯净提取物

 
 
 
图3. 甜叶菊栽培种UEM-320的水提取物渐进的下游的光谱监测。半纯化和纯净样品分别指顺序膜过滤和离子树脂步骤。为进行扫描,所有样品都以0.5 mg/ml的标准浓度溶于二甲亚砜中。
 
3.2甜叶菊栽培种UEM-320中双萜糖苷的含量
 
通过采用高压液相层析(HPLC)(图4A)方法,对甜叶菊栽培种UEM-320中双萜糖苷的含量测定后进行的分析表明,rebaudioside-A的浓度大于甜菊甙的浓度,这对于甜叶菊来说是一个罕见的发现,因为所有的报告都无意例外地认为糖苷是主要成分,这用普通的甜叶菊栽培种产生的商用制备物所做的比较已经证明的一种事实。野生类型甜叶菊总双萜糖苷的含量是13.8%,其中甜菊甙的平均含量为9%,rebaudioside-A的含量为4%。甜叶菊栽培种UEM-320中相应的数据为18.1%(总糖苷含量增加31%),根据采用的不同的分析方法(TLC, HPLC, 后面概述的CE),rebaudioside-A与甜菊甙的比率为1.05-1.15。另外,叶子是植物的一部分,是甜味素最集中的地方,甜叶菊栽培种UEM-320大田产量已经达到每公顷5-6吨叶子,相比之下,野生类型甜叶菊的产量为每公顷2-3吨叶子。
为进行分析和纯化而设计的连续有机溶剂程序清楚地表明甲醇步骤糖基化双萜的不平常的产量。这只是一种明显的结果。相反,产量需要通过以前所惯用的由叶绿素和其他脂溶化合物作为例证的己烷、二氯甲烷和乙酸盐步骤提取的的外来物来解释。
 
 
 
mAU (190nm)           (图)
 
                             Rt (Sec)
 
 
 mAU (190nm)           (图)
 
                             Rt (Sec)
          4. 从甜叶菊栽培种UEM-320中提取的粗(A)和纯的(B)水提取物在无梯度洗脱方式中的高压液相层析
 
3.3 薄层色谱法
 
正如在图2 (重量通道和320)中所提议的和确认HPLC定量测定,野生类型甜叶菊中甜菊甙与rebaudioside-A之比为0.466:0.255,而在栽培种UEM-320中进行的TLC分析中,这个比例成为0.309:0.347,然后,应用比重记测量确定两个样品两种糖苷的量。为此目的而建立的校正曲线(色谱的右边)指出γ2 = 0.993。在栽培种UEM-320的粗和纯净提取物(通道c和p)的相对密度测定再一次证实rebaudioside-A是主要的糖苷。
 
3.4 色素物质的分离
 
尽管粗水提取物也是天然的,但在完全加工的材料中,叶绿素以及包括残余蛋白质在内的其他紫外和可见光吸收的组分都是不需要的。除了在190-210 nm的范围内外,甜叶菊甜味剂不吸收光,指出这点是有益的。因此,全部波长扫描是探索甜味剂下游类似于排除污染物质的时间过程的精确方法。这在图3表示。最终的提取物实际上变成透明的水溶液,即使在浓度高达10-20 g%亦如此,显示出小于在大多数敏感波长(300 nm)测定的初始吸收率的5%。
 
3.5 双萜糖苷的高压液相色谱分辨
 
高压液相色谱方法常用于甜菊糖苷分析。例如,应用已睛在水中的渐进梯度,在C-18反相色谱法中测定了叶子的甜菊甙含量。采用了NH2-柱和无梯度已睛:水(80:20)的比例,以达到甜菊甙、糖苷、rebaudioside-C和rebaudioside-A在增加Rt次序的满意分解 (图4)。除了重要甜味素的定性分析外,该色谱方法证实rebaudioside-A +糖苷的总量占粗提物的54%,用膜过滤和树脂交换后,全部加工样品的这一比例进一步增加到89%。在后一种情况下,高压液相层析区域处理表明rebaudioside-A 与糖苷的比例为46.0:42.8。
考虑到鼠李双萜糖苷,即rebaudioside-C在高压液相色谱中在Rt的峰等于1295 min(图4A),只有30%的rebaudioside-A脱硫粉剂。
 
3.6 甜味剂组分分光镜特征
 
甜菊栽培种UEM-320叶子二氯甲烷提取物在硅胶柱的色谱馏分得到两种类固醇混合物的分离,第一种类固醇含豆甾醇(1a)和β-谷甾醇(2a),第二种类固醇含3-β-O-β-D-吡喃葡糖苷豆甾醇(1b)和3-β-O-β-D-吡喃葡糖苷谷甾醇(2b);这个栽培种叶子的乙酸乙脂提取物中也含有第二种混合物(1b2b)。通过1H, 13C和低分辨EM的RMN光谱数据分析以及与文献中介绍的数据进行比较,可以鉴别出这些物质(图5)。
 
 
 
1a  R = H                                  2a R = H
1b  R =Glc                                 2b R = Glc
 
     图5. 甜叶菊叶子中的植物甾醇糖苷配基和葡糖基化衍生物
 
3.6甜味剂组分分光镜特征
 
甜菊栽培种UEM-320在硅胶柱的色谱馏分,经过膜过滤后,导致双萜甜菊糖苷(3)和rebaudioside-A的分离,rebaudioside-A已经被证实是甜菊栽培种UEM-320的主要组分。通过1H, 13C/DEPT和1H- 13C HETCOR的RMN光谱数据分析以及与文献中有关(3)和(4)两种物质的数据进行比较,可以鉴别出这两种物质(3和4) (表2)。
 
2. 两种物质(34)13C RMN光谱数据和文献中的参考化合物rebaudioside-Arebaudioside-DC5D5N中的比较

C
δ(3)
δ(4)
δrebaudioside-A
δrebaudioside-D
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
1’
2’
3’
4’
5’
6’
1”
2”
3”
4”
5”
6”
1’’’
2’’’
3’’’
4’’’
5’’’
6’’’
1’’’’
2’’’’
3’’’’
4’’’’
5’’’’
6’’’’
40.5
19.1
38.1
43.8
57.3
21.9
41.4
42.4
53.6
39.6
20.4
36.4
85.9
44.2
47.4
154.5
104.5
28.0
177.1
15.2
95.7
73.8
79.1
71.9
78.8
62.3
97.8
84.5
77.9
70.7
77.6
61.8
106.7
76.9
78.4
71.2
78.0
62.6
-
-
-
-
-
-
40.3
18.9
38.0
43.6
57.0
21.7
41.3
42.1
53.6
39.4
20.2
36.5
86.2
44.1
47.3
153.9
104.5
27.9
176.9
15.1
95.5
73.5
78.9
70.6
78.1
62.3
97.9
80.5
87.5
70.3
77.0
61.6
104.5
75.9
78.6
71.2
78.3
62.5
104.5
74.9
77.9
71.5
77.9
61.9
40.9
19.4
38.3
44.0
57.4
22.2
41.8
42.4
54.0
39.8
20.7
37.3
86.6
44.5
47.9
153.9
104.5
28.3
177.0
15.5
95.6
73.8
78.8
70.8
78.8
62.3
97.9
80.7
87.8
70.5
78.3
62.3
104.5
ne
ne
ne
ne
ne
104.5
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
ne
93.7
81.0
77.3
70.9
78.4
63.1
97.6
80.8
88.0
70.0
78.4
63.1
104.5
76.0
78.4
71.6
78.4
62.3
104.5
75.3
78.4
72.1
78.4
62.3

注:ne = 没有评估
= 溶解在氘化的吡啶中的样品
 
 
 
 
 
图6. 甜菊甙 (3)rebaudioside-A (4)的化学结构
 
 
 
 
 
 
 
图7. 甜菊栽培种UEM-320叶子的粗(A)和纯(B)水提取物甜菊糖苷的比较毛细管电泳图
 
 
rebaudioside-A (4)的13C/DEPT的RMN光谱在δC153.9 (C)和104.5 (CH2)出现与烯碳C-16和C-17有关的信号,在δC27.9 (CH3)和15.1 (CH3) 出现与甲基碳C-18和C-20有关的信号,以及酯功能的羰基所特有的δC176.9 (C)上与碳C-19有关的信号。就配糖部分而言,在与异头碳C-1’和C-1’’有关的δC95.5 (CH)和97.9 (CH)观察到了信号,并在与δH5.29 (H-1’’’) , δH 5.52 (H-1’’’’)和δH 4.89和5.60(H-17)中的氢相关的HETCOR等值线图的δC104.5 (CH) 观察到了信号,然后被认为原因是异头碳C-1’’’ (CH)和C-1’’’’ (CH),也是由于烯碳C-17(CH2)的原因。δC62.3 (CH2)、61.6 (CH2)和61.9 (CH2)中的信号分别指的是甲醇亚甲基C-6’, C-6’’, C-6’’’和C-6’’’’,证实4种糖苷单元的存在。文献中对rebaudioside-A描述的13C的RMN光谱数据,除了4种异头碳之外,只显示与C-13碳连接的葡萄糖配糖基和与C-19碳连接的葡萄糖配糖基的信号。在本研究中,根据表2,与C-13连接的3种糖苷单元的碳的化学置换通过与rebaudioside-A的数据进行比较作了解释。
 
3.8 毛细管电泳
 
从浓度为10 mg/ml的储备溶液(可容易地在CE流动缓冲液中稀释)开始,对粗样品所看到的多峰外型(图6;顶部色谱)在纯样品(底部色谱)中产生明显的简单外型。当考虑峰高与有效浓度作为正比从2.09:1.95到5.63:5.15 mg/ml时,也发现了rebaudioside-A:甜菊甙峰比的轻微变化。因此,用于两种和单独糖苷的校正曲线给出γ2值分别为0.9986和0。9974。文献只有关于甜菊糖苷毛细管电泳的两篇报告。前一篇报告利用了一种由45%的乙腈包含物改性的50 mM, pH9.3的硼酸盐缓冲剂,一种根据温度范围导致缓冲剂结晶作用的条件以及25分钟的运转时间。后一篇报告采用了胶束电子色谱(MEKC)方法,在有50 mM十二烷基硫酸盐存在,并与纯甲醇样品的溶解相结合,以便部分改善rebaudioside-A和甜菊甙重叠峰的分辨。我们发现更多的碱性硼酸盐缓冲剂,pH10.3;因此,增加毛细管信号组的电离作用和导致的电内渗流,证明有益于溶液的改善和缩短运作时间(图7)。该系统也包括与流动缓冲剂和样品溶液中22.5%的乙腈 + 15%的甲醇 相结合的3 mM γ-环糊精,并进一步让甜菊醇B甙和普通的糖苷配基甜菊醇分解。
 
鸣谢
 
作者Antonio Sergio Dacome 感谢马林加洲立大学生物化学系,由于该系的半工半薪教学制度,是作者完成了他的硕士论文。中国甜菊协会组织翻译
 
                                参考文献(略)
 

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