[甜菊安全性评估]作为DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶抑制剂的 
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  甜菊安全性评估  

[甜菊安全性评估]作为DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶抑制剂的

 

Yoshiyuki Mizushina, Toshihiro Akihisa, Motohiko Ukiya, Yusuke Hamasaki, Chikako Murakami-Nakai, Isoko Kuriyama, Toshifumi
 
摘要
异甜菊醇(内-16-酮-beyeran-19-酸)是一种甜菊甙的水解产物,它是甜叶菊(Stevia Rebaudiana)的叶子中产生的一种甜味剂。在本研究中,我们通过微生物转化作用和化学转化方法从甜菊甙中制备了异甜菊醇和相关化合物,并检验了DNA代谢酶和人癌细胞生长的抑制活性。在所得到的12种化合物中,只有异甜菊醇(化合物3)有效地抑制了哺乳动物DNA聚合酶(pols)和人DNA拓扑异构酶 II (topo II),DNA聚合酶α的LC50值为64.0 μM。这种化合物对高等植物(花椰菜)的聚合酶、原核聚合酶、人局部异构酶I以及DNA代谢酶,例如人端粒酶、T7 RNA 聚合酶、以及牛脱氧核糖核酸酶I没有抑制效果。在有聚合酶α时,异甜菊醇与DNA摸板-引物和核苷酸酶底物不起作用。异甜菊醇抑制了人癌细胞的生长,其LC50值为84-167 μM, 500 μg的化合物使对酸肽(TPA)导致的炎症显著减少(抑制效果为53.0%)。对以异甜菊醇为基础的化合物的结构和它们的活性之间的关系进行了讨论。
 
关键词:异甜菊醇,DNA聚合酶, DNA拓扑异构酶, 酶抑制剂, 细胞毒性,抗炎作用
 
引言
 
甜菊甙(化合物1)是由三个葡萄糖分子形成的糖苷,甜菊醇(化合物2)是一种双萜羧醇(图1)。甜菊甙是一种高强度甜味剂,其甜味比蔗糖(0.4%的溶液)甜300倍。在许多国家,甜菊甙作为一种低热甜味剂广泛用于食品和饮料。甜菊糖苷作为一种甜味剂在南美、亚洲、日本、中国以及欧盟一些国家已用了多年,而在美国,作为一种食品添加剂从1995年开始使用。从甜叶菊提取的产品在巴西、韩国、和日本被批准作为甜味剂(Kinghorn, 2002)。甜菊糖苷作为接受实验人的食品添加剂的优点是多种多样的:它是稳定的、无热量、由于减少糖的摄入而维持牙齿健康、有可能用于糖尿病患者、苯酮尿病人和肥胖病人。
我们曾报道过新奇的抗对酸肽(TPA)导致的炎症的化合物,即一种新奇的萜烯苯酸(即Myrsinoic acid A, MAA), 新奇的三萜系化合物(即tormentic acid, TA和euscaphic acid, EA)和一些酚类化合物,例如姜黄素,是哺乳动物DNA聚合酶α、β、λ(pol α、β、λ)的抑制剂。尽管肿瘤引发物是引发肿瘤形成的化合物,这些化合物也能导致炎症,而且一般用作人工炎症诱发物,以便筛选抗炎剂(Fujiki 和Sugimura ,1987)。肿瘤引发物诱发的炎症可以和急性发炎区分开,急性发炎是渗出的,并伴随着成纤维细胞增生和颗粒形成。对酸肽不但导致炎症,而且影响哺乳动物细胞生长(Nakamura 等,1995),说明炎症的分子学基础是聚合酶与细胞增生相关的反应。在本报告中,我们研究了甜菊糖苷、异甜菊醇和相关化合物抗聚合酶和DNA代谢酶的作用模式,聚合酶和DNA代谢酶担负着导致细胞增生的DNA的复制和DNA修复/重组,并研究了细胞生长抑制效果和抗炎活性程度之间的关系。
我们在此报道的化合物之一,即异甜菊醇(化合物3),是哺乳动物聚合酶和人DNA拓扑异构酶II(topo II)的有效抑制剂。哺乳动物聚合酶和人DNA拓扑异构酶II被认为是开发抗癌剂中对于化学干预的重要细胞目标。异甜菊醇抑制了人癌细胞的生长和TPA诱发的炎症。因此,与甜菊甙为基础的化合物结构特征有关的信息可能对新的抗癌剂设计提供有价值的了解。
 
 
 
 
                                (图)
图1. 异甜菊醇和有关化合物的化学结构
      化合物1:甜菊甙,化合物2:甜菊醇,化合物3:异甜菊醇,化合物4:11β-羧异甜菊醇,化合物5:7β-羧异甜菊醇,化合物6:12β-羧异甜菊醇,化合物7:17β-羧异甜菊醇,化合物8:7-氧代异甜菊醇,化合物9:甲基 ent-15β,16β-expoxy-13-hydroxykauran-19-oate, 化合物10:异甜菊醇甲酯,化合物11:甲基 ent-16β-hydroxykauran-19-oate, 化合物12:甲基 ent-7α,16β-hydroxykauran-19-oate。
 
材料和方法
 
材料
    [3H]-dYYP (2'-脱氧胸苷三磷酸5'-三磷酸) (43 Ci/mmol), 核苷酸和化学合成的摸引物, 例如多聚物(dA)和寡聚物(dT)12-18, 从英国的Amersham Biosciences公司购得。超螺旋pUC19质粒DNA和pBR322 DNA从日本东京的Takara公司得到。所有其他分析级试剂都是从日本东京的Nacalai Tesque 公司购得。
 
化学药物
甜菊糖苷(化合物1),异甜菊醇(ent-16-ketobeyeran-19-oic acid, 化合物3),11β-羧异甜菊醇 (化合物4), 7β-羧异甜菊醇(化合物5), 12β-羧异甜菊醇(化合物6), 17β-羧异甜菊醇(化合物7), 7-氧代异甜菊醇(化合物8)的来源在我们最近的研究中已经作了介绍(Akihisa等,2004)。因此, 甜菊甙(化合物1)由Horiuchi  食品责任有限公司 (日本东京)惠赠。异甜菊醇(化合物3)是通过甜菊糖苷与稀盐酸的水解作用得到的。用异甜菊醇(化合物3)培养黑曲霉(Aspergillus niger)IFO 9767菌种得到7β-羧异甜菊醇(化合物5),11β-羧异甜菊醇 (化合物4)以及12β-羧异甜菊醇(化合物6)。通过围小丛壳(Glomerella cingulata) IFO 9767转化异甜菊醇(化合物3)生产出17β-羧异甜菊醇(化合物7)。通过长孢被孢霉(Mortierella elongate) IFO 8570转化异甜菊醇(化合物3)得到7-氧代异甜菊醇(化合物8)。
甜菊醇 (化合物2)是通过利用真菌黑曲霉(A. niger)IFO 4414微生物转化甜菊糖苷(化合物1)后得到的(Subrahmanyam等,1999)。甲基 ent-15β,16β-expoxy-13-hydroxykauran-19-oate (化合物9)是通过用甜菊醇 (化合物2)与m-氯过苯甲酸(m-chloroperbenzoic acid)在二氯甲烷中产生环氧化作用,接着与重氮甲烷发生酯化作用而得到的。异甜菊醇(化合物3)与重氮甲烷发生酯化作用产生了异甜菊醇甲酯(化合物10)(Avent 等,1990a,b),异甜菊醇甲酯(化合物10)与NaBH4在乙醇中经还原反应产生了甲基 ent-16β-hydroxykauran-19-oate(化合物11)(Ali等,1992)。异甜菊醇(化合物3)和NaBH4发生还原反应,继之于通过重氮甲烷发生酯化作用得到甲基 ent-7α,16β-hydroxykauran-19-oate(化合物12)(Ali等,1992)。化合物2、9、10、11、以及12通过质谱法和1H核磁共振(NMR)进行了鉴定,并与文献中相应的化合物进行了比较。
 
 
    按照以前介绍的免疫吸附柱层析方法从小牛胸腺纯化得到聚合酶α(Tamai等,1988)。按照Date等(1988)介绍的方法,重组大鼠聚合酶β从大肠杆菌JMpβ5经纯化得到。根据以往介绍的方法(Shimazaki等,2002),组氨酸聚合酶λ进行了超量表达和纯化。从高等植物花椰菜的花序得到的聚合酶I(类α)和聚合酶II(类β)按照Sakaguchi等(1980)的方法进行了纯化。来自大肠杆菌的聚合酶I和人免疫缺陷病毒(HIV)类型-I逆转录酶(重组体)的Klenow 片段是从美国Worthington Biochemical Crop.公司(Freehold, 新泽西州, 美国)购买的。T7 RNA聚合酶是从日本东京的Takara购买的。纯化的人胎盘拓扑异构酶I和II(2单位/ml)是从美国TopoGen 公司得到的(Columbus, OH, 美国)。牛胰腺脱氧核糖核酸酶I(DNase I)是从美国Stratagene Cloning Systems 公司(LaJolla, 加里福尼亚,美国)购买的。
 
DNA聚合酶测定
 
应用先前介绍的方法(Mizushina等,1996, 1997)测定了聚合酶的活性。使用的聚合酶的底物是多聚物(dA)/寡聚物(dT)12-18以及dTTP(脱氧胸苷三磷酸),分别作为摸板-引物DNA和核苷酸底物。不同浓度的异甜菊醇和相关化合物溶解于二甲亚砜(DMSO),并用声处理30秒。声处理过的样品4μl 的整分与16μl每种酶(0.05单位)在50 mM Tris-HCl (pH 7.5)混合,Tris-HCl中含1 mM二硫赤藓糖醇、50%甘油、和0.1 mM EDTA,并保持在0℃10秒钟。将这些抑制剂-酶的混合物(8μl)加入到16μl每种酶的标准反映混合物中,并在37℃温育60分钟。在没有抑制剂时的活性被认为是100%,对在抑制剂每种浓度下酶的活性进行了测定。一个单位的聚合酶活性被定义为对1 nmol脱氧胸苷三磷酸(即dTTP)掺入合成的摸板-引物(即多聚物(dA)/寡聚物(dT)12-18,A/T = 2/1),在37℃正常反应条件下每一种酶的需要量。
 
其他酶的测定
 
T7 RNA聚合酶和牛胰腺脱氧核糖核酸酶I的活性是根据Nakayama 和Saneyoshi (1985)以及Lu和Sakaguchi (1991)介绍的生产厂商的说明,应用标准测定方法测定的。端粒酶活性是按照Kim等(1994)的由Ueno等 (2000)作了一些改进的聚合酶链反应(PCR)为基础端粒重复扩增方法测定的。
 
对人癌细胞的细胞毒性的研究
 
为研究异甜菊醇和相关化合物在体内的影响,从日本大阪的卫生科学研究银行(Health Science Research Bank, Osaka Japan)获得人T细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4,人B细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系BALL-1,以及人的肠癌细胞系NUGC-3。这些细胞按常规方法培养在RPMI1640培养基,并添加了10%牛胎儿血清、100 μg/ml链霉素、100 单位/ml青霉素和1.6 mg/ml NaHCO3,在37℃、5%的CO2-95%空气的湿润大气中培养。化合物的细胞毒性按下述方法进行了研究。高浓度(10 mM)的化合物溶解在DMSO和贮存液中。在96-孔微量培养板中每个孔接种大约5 X 103个细胞,然后将化合物的贮存液稀释到各种不同浓度,并施与每个孔中。温育48小时后,通过MTT(3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物)测定甜菊醇的量(Mosmann, 1983)。
 
抗炎检定
 
根据Gschwendt的方法(Gschwendt等,1984)进行了大鼠炎症实验。该实验完全遵照有关动物实验的规定和Kobe-Gakuin大学的动物保护 规章进行。简单地说,实验化合物的甲醇溶液(250或者 500μg/20μl) 施于大鼠的耳朵内。实验化合物应用后30分钟,TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯)溶液(0.5μg/20μl 丙酮)施于耳朵的同一部位。同一只大鼠的另一只耳朵施用甲醇和TPA溶液作为对照。7个小时后,从耳朵得到切片(直径6 mm),并秤重。抑制效果(IE)按耳朵切片的增重率表示:即IE:{[(只有TPA)-(实验化合物加TPA)]/[(只有TPA)-(只有TPA)-(载体)] x 100}。
 
异甜菊醇衍生物的计算分析
 
建立了化合物模型,并作了简单最小化。化合物模型用以相容价力域(CVFF)为基础的力域参数进行了模拟。引用了以群为基础的断开器,即van der Waals 为0.95 nm,Coulomb 反应为0.95 nm。温度调整在298 K。应用INSIGHT II(Accelrys 公司, 圣叠戈,加里福尼亚,美国)对模拟图象进行了计算。用Weblab ViewerLite (3.2板,Accelrys 公司, 圣叠戈,加里福尼亚,美国)软件对化合物表面的静电势进行了分析。
 
结果和讨论
 
异甜菊醇和有关化合物对DNA聚合酶和其他DNA代谢酶的影响
 
作为对DNA代谢酶抑制物的初选,我们实验了异甜菊醇和有关化合物对(化合物1-12,图1) 哺乳动物聚合酶α、β和λ以及植物和原核生物繁荣聚合酶的效果。我们确定了LC50值低于200 μM的化合物是酶活性的抑制剂。如图1 所示,化合物3(异甜菊醇)抑制了哺乳动物聚合酶(α、β和λ)的活性,但对高等植物(花椰菜)聚合酶I(类-α聚合酶)和II(类-β聚合酶)以及原生生物聚合酶,例如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段没有影响。其他化合物,1-2和4-12对哺乳动物聚合酶没有影响(表1)。另外,化合物1、3和7抑制人拓扑异构酶II活性(表1)。另外,任何化合物对人拓扑异构酶I活性都没有影响。化合物对高等植物(花椰菜)聚合酶I(类-α聚合酶)和II(类-β聚合酶)以及原生生物聚合酶,例如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段和DNA代谢酶,例如T7 RNA聚合酶、人免疫缺陷病毒(HIV)I-型逆转录酶、人端粒酶和牛脱氧核糖核酸酶I没有影响(表1)。
 
 
 


 

表1. 异甜菊醇和有关化合物对各种DNA聚合酶和其他DNA代谢酶的LC50

化合物(μM)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
小牛聚合酶α
大鼠聚合酶β
人聚合酶λ
花椰菜聚合酶Ia
花椰菜聚合酶IIb
大肠杆菌聚合酶I
T7 RNA聚合酶
HIV-RTc
人端粒酶
人拓扑异构酶I
人拓扑异构酶II
牛DNase Id
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
  90.0
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
 190.0
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
 82.5
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
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>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000

a 类-αDNA聚合酶;b 类-βDNA聚合酶;c 逆转录;d脱氧核糖核酸酶I。
 
这些观察表明,一些以甜菊甙为基础的化合物是哺乳动物聚合酶和人拓扑异购酶II的抑制剂,在这12种化合物中,异甜菊醇(化合物3)作为哺乳动物聚合酶和拓扑异购酶II是最重要的。在结构上,所有的化合物都由一个四环双萜烯酮和一个beyerane骨架以及一个羧基组成(图1)。化合物1是由3个葡萄糖分子组成的葡糖苷,化合物2-8有一个自由羧基,化合物9-12有羧基的一个甲基酯。化合物3(异甜菊醇)有一个酮基,但没有羟基。从表1的结果可以看出,没有羟基、有一个羧基和双萜的一个酮基,被认为可能对哺乳动物聚合酶的抑制是重要的。
为确定是否一个四环双萜烯酮,例如化合物3与DNA结合,在有小牛胸腺双螺旋DNA(dsDNA)存在的情况下测定了溴化乙锭(EtBr)荧光发射光谱和化合物。当EtBr中插入dsDNA时,EtBr-dsDNA复合体的荧光增加,最大发射波长为595 nm。化合物3在高浓度(即1000μM)的情况下未观察到EtBr荧光的减少(数据未显示出)。这样,化合物3并没有结合和插入dsDNA,说明通过与酶直接反应抑制了酶的活性。
因此,我们在本研究的后一部分集中研究了化合物3的性质。
 
化合物3对哺乳动物DNA聚合酶和人DNA异构酶活性的影响
 
 
 
                             (图)
图2显示出化合物3对哺乳动物聚合酶和人拓扑异构酶抑制的剂量反应曲线。聚合酶α是复制聚合酶,聚合酶β和λ是修复和重组相关的聚合酶。
 
 
 
 
 
 
                DNA聚合酶/拓扑异构酶活性(%)
 
 
                                            化合物3(μM)
 
图2. 化合物3对哺乳动物聚合酶和人DNA拓扑异构酶抑制的剂量反应曲线。使用的酶是小牛聚合酶α(封闭的圆圈)、大鼠聚合酶β(封闭的三角形)、人聚合酶λ(封闭的正方形)、人拓扑异构酶I(开放的正方形)和人拓扑异构酶II(开放的圆圈)。聚合酶和拓扑异构酶的活性按材料和方法一节介绍的方法测定。没有添加化合物的酶的活性取为100%。
 
化合物对抑制小牛聚合酶α、大鼠聚合酶β、人拓扑异构酶II的活性是有效的,抑制依赖于使用剂量,在剂量分别为64.0, 177, 103和190μM时,对聚合酶α、β、λ和人拓扑异构酶II抑制是50%。在所实验的DNA代谢酶类中,化合物3对聚合酶α的抑制力最强(图2)。在相同的条件下,由于复制聚合酶,例如聚合酶α、δ和ε的抑制剂蚜肠霉素的LC50值对于聚合酶α是20-40μM(Ikegami等,1978),因此化合物看来不是这样的强抑制剂。另外,该化合物没有影响人拓扑异构酶I的活性。这些观察表明化合物3对于哺乳动物聚合酶,特别是对于聚合酶α,是一种选择性抑制剂。
 
化合物3对DNA聚合酶α抑制的方式
 
为阐明化合物的抑制机理,在添加或者不添加化合物3的情况下,作为DNA摸板引物或者脱氧核糖核苷三磷酸盐(dNTP)浓度的一种功能对抑制的范围进行了测定(图3)。在动力学分析中,多(dA)/寡(dT)12-18以及dTTP分别用作DNA摸板引物或者核苷酸酶底物。双方相互结果的绘图表明,化合物介导的聚合酶α活性的抑制在有DNA摸板引物或者核苷酸酶底物时是非竞争性的。在DNA摸板引物的情况下,在添加25和50μM化合物3时,观察到最大速度(Vmax)分别降低35.7%he  62.5%,而表观米氏常数(Km)没有变化,仍为13.0 μM(图3A)。在添加50μM化合物3时,核苷酸酶底物的米氏常数(Km)没有变化,仍为1.65 μM,核苷酸酶底物的最大速度(Vmax)从29.2 pmol/h下降到17.2 pmol/h(图3B)。当活化DNA和dNTP分别用做DNA摸板引物或者核苷酸酶底物时,化合物3对聚合酶α抑制的方式与多(dA)/寡(dT)12-18以及dTTP分别用作DNA摸板引物或者核苷酸酶底物时是相同的(数据未显示出)。这些发现说明,化合物3与聚合酶α的结合位点与聚合酶α和DNA摸板引物以及核苷酸酶底物的结合位点不同。
从图3C和D的Dixon 绘图得到的对聚合酶α的抑制常数(Ki) DNA摸板引物和核苷酸酶底物分别是27.5和57.0μM。
 
 
                             (4个图)
(A)
1/V (pmol/h-1)
 
                          
 
 1/S(μM-1) 多(dA)/寡(dT)12-18
 
 
 
    (B)
1/V (pmol/h-1)
 
 
 
1/S (μM-1)dTTP
 
 
    (C)
1/V (pmol/h-1)
 
 
 
         化合物3(μM)
 
 
 
 
     (D)
1/V (pmol/h-1)
 
 
 
         化合物3 (μM)
 
图3. 化合物3对DNA聚合酶α抑制的动力学分析。(A和B)Lineweaver-Burk双相互绘图是通过不同的DNA摸板引物浓度(A)和核苷酸酶底物浓度(B)得到的。在添加和不添加25(圆圈)和50(三角) μM化合物3时对人聚合酶α的活性进行了检验(C和D)。在A和B数据的基础上从绘制的Dixon图测定的抑制常数(Ki)分别为27.5和57.0μM。检测混合物中人聚合酶α的量是0.05单位。
 
异甜菊醇和有关化合物对培养的人癌细胞的影响
 
在开发抗癌制剂中,聚合酶和拓扑异构酶被认为是进行化学干预的重要细胞靶。因此,甜菊甙、异甜菊醇和相关化合物在化学治疗中将是有用的。我们在体外实验了12种化合物对人T细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4的细胞毒性影响。
如图4所示,200μM化合物3对于癌细胞系具有很强的生长抑制效果,而其他化合物没有抑制细胞的生长。化合物3对MOLT-4细胞的生长抑制作用是剂量依赖性的,LD50需要的浓度是84μM (图4B)。
 
 
                       (两个图)
 
 
 
(A)                                                                 
化合物1-12
 
 
 
 
                                    相对活性(%)
 
 
(B)                                                                 细胞生活力(%)
 
 
 
 
                                化合物3 (μM)
 
图4. 异甜菊醇和有关化合物对人癌细胞的影响。(A) 12种异甜菊醇和相关化合物(每一种200μM)对人T细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4的细胞生长抑制。(B) 化合物3对人癌细胞生长抑制的剂量反应曲线。MOLT-4(圆圈),BALL-1(人B细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系,三角形)和NUGC-3(人肠癌细胞系,正方形)。检测是在材料和方法中介绍的条件下,并按指出的化合物3的浓度进行的。存活率通过MTT检测方法(Mosmann, 1983)测定的。所示的数值是三次单独实验的平均值±SEM。
 
化合物3也抑制了人B细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系BALL-1和人肠癌细胞系NUGC-3的生长,LD50分别是87和167 μM。对MOLT-4的剂量反应曲线几乎与对BALL-1的相同,表明化合物3对于B细胞或者T细胞不是选择性地抑制(图4B)。对非黏着细胞系(即MOLT-4和BALL-1)的抑制效果大于对黏着细胞系(即NUGC-3细胞)的抑制效果。化合物3对淋巴细胞的LD50值在体外与对聚合酶α的LD50值相似。聚合酶和细胞生长的抑制曲线显示出平行的依剂量的减少。这些观察说明,细胞生长抑制是依赖于酶抑制的方式发生的。因此,化合物3被认为抑制了完整细胞中聚合酶的活性,尤其是聚合酶α的活性。由于化合物3在S-阶段也抑制了细胞(数据未显示出),这种化合物可能存在于细胞核中,并影响细胞周期的进展。
 
化合物3抗炎活性的效果
 
应用大鼠的炎症实验,我们检测了化合物3的抗炎活性。向大鼠耳朵中施用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)(0.5 μg )诱发了浮肿,施用7小时后耳朵圆盘增重为241%。如表2所示,在所有化合物的实验中,用250μg和500μg化合物5预先进行处理,使得TPA诱发的炎症减轻最大,其抑制效果(IE)分别为25.8%和53.0%。由于化合物3 (500μg)的抑制效果大于50%,这种化合物被认为抗炎效果。TPA是一种促使肿瘤发生的化合物(Hecker, 1978),一般用作人工炎症诱发剂。由TPA诱发的炎症与急性炎症不同,它伴随着成纤维细胞增生和成粒作用。这些结果说明,肿瘤发生中所谓的增生过程的分子基础也包括需要聚合酶的生化过程。
 
异甜菊醇和相关化合物的三维结构
 
为了解甜菊糖苷、异甜菊醇以及10种化合物表现出来的差示抑制的分子基础的信息,应用分子模拟和表面分析软件进行了计算分析(图5)。化合物的三维分子结构如图5(1-12)所示。这些化合物的静电势显示了它们在总的排列和关系上的显著差异。在恒定的电子密度表面(每一个排列接近van der Waals表面)每一个点的静电势由图来表示,图中的红色相当于静电势大部分为负的区域,蓝色相当于静电势大部分为负的区域。
 
表2. 在大鼠炎症实验中化合物3的抗炎活性

化合物
抑制效果(%) (±S.E.)
250 μg/耳
500 μg/耳
化合物3
25.8 (±5.4)*
53 (±4.8)*

S.E.写在括号内。样品(250 μg或者500 μg)施于大鼠的一个耳朵,30分钟后,TPA(0.5 μg)施于大鼠的两个耳朵。7小时后对水肿进行了测定,抑制效果水肿的百分率表示。每个实验用5只大鼠。*应用Student’s t检验法为显著差异,P<0.05。
 
                           
 
                                    (图5)
图5. 异甜菊醇和相关化合物的计算机图形。化合物1:甜菊糖苷,化合物2:甜菊醇,化合物3:异甜菊醇,化合物4:11β-羧异甜菊醇, 化合物5:7β-羧异甜菊醇, 化合物6:12β-羧异甜菊醇,化合物7:17β-羧异甜菊醇,化合物8:7-氧代异甜菊醇,化合物9:甲基 ent-15β,16β-expoxy-13-hydroxykauran-19-oate,化合物10:菊醇甲酯,化合物11:甲基 ent-16β-hydroxykauran-19-oate,化合物12:甲基 ent-7α,16β-hydroxykauran-19-oate。应用图形程序INSIGHT II(Acce;rys Inc., San Diego, CA, USA)建立了化合物1-12的条状模型。碳、氧、氢分别用灰色、红色和白色表示。应用Weblab ViewerLite 软件(3.2版,Acce;rys Inc., San Diego, CA, USA)分析了分子表面的静电势。蓝色区域带正电,红色区域带负电,白色区域不带电(见材料和方法)。
 
如图5(3)所示,异甜菊醇(化合物3)包括一个疏水区(上表面)和在羧基(下左)和酮基(下右)中氧原子上的两个负静电荷。其他化合物拥有另外的负电荷或者正电荷。下述分子特征对于抑制聚合酶活性、细胞毒性和抗炎症可能是重要的:[1]带有beyerane骨架的四环双萜(即疏水区),[2]一个羧基,[3]一个酮基,[4]没有羟基。
如前所述,硫代-糖酯也同样能抑制哺乳动物聚合酶活性(Hanashina等,2000;Oheta等,2000),是有效的体内抗癌剂(Sahara 等1997,2002)。因此,化合物3被认为是抗癌剂可能的候选物。
中国甜菊协会组织翻译

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